ตรวจสอบเชื้อไข้หวัดนกด้วยเทคนิค real-time RT-PCR

เรียบเรียงโดย เอกดนัย กอกิมพงษ์
      การตรวจสอบเชื้อไข้หวัดนก (Influenza A H5N1) ปัจจุบันสามารถทำได้หลายวิธีทั้งการทดสอบอย่างรวดเร็วโดยใช้ชุดทดสอบและการตรวจสอบในห้องปฏิบัติการ หนึ่งในวิธีที่นิยมใช้และให้ผลแม่นยำที่สุดก็คือการตรวจสอบด้วยวิธี real time RT-PCR ซึ่ง ปัจจุบันได้มีการใช้ primer ที่เหมาะสมมากขึ้น ร่วมกับใช้เทคนิค multiplex real-time RT-PCR ทำให้การตรวจสามารถทำได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำยิ่งขึ้นตรวจสอบเชื้อไข้หวัดนกด้วยเทคนิค real-time RT-PCR

บทนำ
        Real-time PCR เป็นเทคนิคที่ใช้เพิ่มและตรวจสอบปริมาณ DNA ได้พร้อมกัน โดยใช้ probe ที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงชนิดต่างๆ ทำให้ทราบปริมาณ DNA ที่เพิ่มขึ้นได้ในเวลาหลังจากกระบวนการ PCR เพียงไม่กี่วินาที ซึ่งเร็วกว่าเทคนิค PCR แบบดั้งเดิมมาก และยังสามารถตรวจสอบปริมาณ DNA เริ่มต้นได้อีกด้วย เทคนิคนี้เป็นหนึ่งในเทคนิคที่ใช้สำหรับตรวจสอบเชื้อไข้หวัดนก (Influenza A H5N1) ซึ่งเป็นปัญหาใหญ่ที่สำคัญมากในปัจจุบัน โดยการตรวจเชื้อไข้หวัดนกนั้นจะใช้เทคนิค reverse transcription โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase เพื่อเปลี่ยนสารพันธุกรรมของไวรัสซึ่งเป็น RNA ให้กลายเป็น DNA ก่อน แล้ว
จึงนำไปเพิ่มจำนวนด้วยวิธี real-time PCR เรียกเทคนิคนี้สั้นๆว่า real-time RT-PCR

รูปที่ 1 Influenza Virus

รูปที่ 2 ไก่ที่ติดเชื่อไวรัสไข้หวัดนก

การตรวจสอบเชื้อไวรัสไข้หวัดนกโดยใช้เทคนิค
real-time RT-PCR
        แต่เดิมการตรวจสอบเชื้อไข้หวัดนกทำโดยใช้เทคนิค RT-PCR แบบเดิม คือ เมื่อได้ตัวอย่าง RNA มาแล้วเปลี่ยนเป็น DNA และเพิ่มจำนวนด้วยวิธี PCR แล้วจึงตรวจสอบผลด้วยทำ Southern blot หรือ RFLP ต่อมาจึงได้พัฒนามาใช้เทคนิค real-time RT-PCR ที่มีพื้นฐานในการตรวจสอบยีน H5 จาก avian influenza virus ในสัตว์ปีก โดยวิเคราะห์ด้วยเทคนิค nested real-time PCR สำหรับวิธีการที่นำมาใช้กับตัวอย่างจากมนุษย์ขณะนั้นยังไม่ได้ถูกคิดค้นขึ้นมา ทำให้มีการพัฒนาวิธีการตรวจสอบโดยวิธี real-time RT-PCR ที่มีความไวสูง รวดเร็ว ตรวจสอบได้ตรงจุด และให้ผลที่แม่นยำขึ้นมา เพื่อใช้ตรวจสอบไวรัส influenza A subtype H5 ในมนุษย์โดยเฉพาะ และได้ถูกนำไปใช้ในการตรวจสอบเชื้อไข้หวัดนกในฮ่องกงและเวียดนาม  ซึ่งวิธีนี้เป็นวิธีที่มีความว่องไวและรวดเร็วกว่าเทคนิค nested RT-PCR แบบเดิม (ปัจจุบัน ประเทศไทยใช้วิธีการวิเคราะห์แบบนี้เช่นกัน)
        Real time RT-PCR ที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์เชื้อไข้หวัดนกในมนุษย์นี้เป็นเทคนิคแบบ multiplex real-time RT-PCR โดยใช้การผสมกันของ primer ที่ได้รับการออกแบบมาเป็นพิเศษ 2 ชุด และ dual-labeled fluorescent probe ซึ่งจำเพาะกับเป้าหมายที่ต่างกัน 2 ตำแหน่ง ของ HA ยีน ใน H5N1 โดยไพรเมอร์และ dual-labeled fluorescent probe ที่ใช้ในเทคนิคนี้แสดงได้ดังตารางที่ 1 การตรวจวิเคราะห์เชื้อไข้หวัดนกด้วยเทคนิค real-time RT-PCR มีกระบวนการ 2 ขั้นตอน คือ การทำ reverse transcription และการทำ real-time PCR

Reverse Transcription
        ไวรัสไข้หวัดนกมีสารพันธุกรรมเป็น RNA การจะนำสารพันธุกรรมของไวรัสจากตัวอย่างไปเข้าสู่กระบวนการเพิ่มจำนวนด้วยวิธี real-time PCR จึงจำเป็นต้องทำให้สารพันธุกรรมเปลี่ยนจาก RNA มาเป็น DNA ก่อน ด้วกระบวนการ reverse transcription โดยเอนไซม์ reverse transcriptase ซึ่งเริ่มทำโดย สกัด RNA จากตัวอย่างส่งตรวจ 140 ไมโครกรัม ใน phosphate-buffered saline หรือ viral transport medium ด้วย viral RNA kit แล้วจึงชะออกด้วย AVE บัฟเฟอร์ 60 ไมโครลิตร สำหรับในหลอดปฏิกิริยา reverse transcription ประกอบไปด้วย สารละลาย RNA 4.2 ไมโครลิตร PCR บัฟเฟอร์ 10x 2 ไมโครลิตร hexamer primer 2.4 ไมโครโมล ตัวยับยั้งเอนไซม์ย่อย RNase (RNase inhibitor) 20 หน่วย และ เอนไซม์ reverse transcriptase 1 ไมโครลิตร ปฏิกิริยานี้ใช้อุณหภูมิตามลำดับ ดังนี้ คือ เริ่มจากผสมแล้วไว้อุณหภูมิห้อง 10 นาที เพิ่มเป็น 42 องศาเซลเซียส 30 นาที และสุดท้ายเพิ่มอุณหภูมิเป็น 95 องศาเซลเซียสอีก 5 นาที หลังเสร็จสิ้นกระบวนการจะได้ cDNA ที่จะนำไปใช้สำหรับเพิ่มจำนวนในการทำ real-time PCR ทั้งหมดประมาณ 5 ไมโครลิตร

Real-time PCR
        สำหรับปฏิกิริยา real-time PCR นั้น ในหลอดปฏิกิริยาแต่ละหลอดจะมีสารละลายอยู่ทั้งหมด 20 ไมโครลิตร ประกอบไปด้วย

ตารางที่ 1 ไพรเมอร์และ dual-labeled fluorescent probe สำหรับการตรวจสอบ H5 ในกระบวนการ real-time RT-PCR


       DNA master hybridization probe 2 ไมโครลิตร แมกนีเซียมคลอไรด์ 3 นาโนโมล/ลิตร primer แต่ละชนิด อย่างละ 250 นาโนโมล/ลิตร และ dual-labeled fluorescent probe แต่ละชนิดอย่างละ 125 นาโนโมล/ลิตร สำหรับขั้นตอนการเพิ่มจำนวน DNAในปฏิกิริยา real-time PCR ซึ่งจะทำทั้งหมด 50 รอบ มีดังนี้
        ขั้น denaturation 95 องศาเซลเซียส 10 วินาที
        ขั้น annealing 56 องศาเซลเซียส 15 วินาที
        ขั้น extension 72 องศาเซลเซียส 12 วินาที
        ที่จุดสิ้นสุดของขั้นตอน annealing ทุกรอบ สัญญาณของฟลูออเรสเซนในแต่ละปฏิกิริยา จะถูกวัดที่ความยาวคลื่น 530 นาโนเมตร
         • Nested real-time PCR 
         เทคนิคนี้มักใช้กับการตรวจสอบ DNA ที่มีความไวต่อสิ่งกระตุ้น สูง และในตัวอย่างที่มีปริมาณ DNA เริ่มตน้ นอ้ ย (low-abundance transcripts) โดยประกอบไปด้วยปฏิกิริยาการเพิ่มปริมาณ DNA 2 ขั้นตอน คือ ขั้นแรกเพิ่มปริมาณ DNA โดยกระบวนการ real-time PCR ปกติก่อน จากนั้นนำ DNA ที่เพิ่มปริมาณแล้ว มาเพิ่มจำนวน โดยการทำ กระบวนการ real-time PCR อีกครั้ง ซึ่งในหลอดปฏิกิริยาหลอดใหม่จะมี primer อีกชนิดหนึ่งที่สามารถเพิ่มปริมาณ
DNA ได้เร็วกว่า primer ชนิดแรก จึงทำให้เพิ่มปริมาณ DNA ได้เร็วขึ้น เทคนิคนี้ถูกนำไปใช้ในการตรวจสอบเชื้อไข้หวัดนกในช่วงที่มีการระบาดในช่วงแรก
        • Multiplex real-time PCR
        เทคนิคนี้เป็นการเพิ่มปริมาณ DNA หลายชนิดในปฏิกิริยาครั้งเดียว มักใช้ในการตรวจวิเคราะห์หาไวรัสที่ก่อให้เกิดโรคเกี่ยวกับระบบทางเดินหายใจ เช่น influenza virus เทคนิคนี้ ทำโดยใช้ primer หลายชนิดในปฏิกิริยาครั้งเดียว และเพราะว่าเทคนิคนี้ใช้ primer หลายชนิด จึงต้องมีการหาสภาวะที่เหมาะสม ซึ่งทำให้ทุก primer สามารถเพิ่มปริมาณ DNA ได้พอๆกันก่อนจึงจะเริ่มทำปฏิกิริยาจริง สำหรับการตรวจสอบเชื้อไข้หวัดนกนั้นจะใช้ primer หลายชนิด ซึ่งแต่ละชนิดจะใช้สำหรับตรวจสอบยีนที่แตกต่างกัน เช่น ยีน H5, N1 และ M เป็นต้น (อาจมีการใช้ primer ที่ตรวจสอบยีนชนิดอื่น เช่น ยีน H2, H3 และ H7 ร่วมด้วย)

การแยกความแตกต่างของไวรัสไข้หวัดนก
        โรคไข้หวัดนกคือโรคที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัส Influenza A ชนิด H5 และ H7 ซึ่งโรคไข้หวัดนกสามารถแบ่งออกได้เป็น 2 ชนิด คือ ชนิดรุนแรงและไม่รุนแรง ซึ่งชนิดที่ระบาดรุนแรงในขณะนี้คือ ชนิด H5N1 ในการตรวจวิเคราะห์เชื้อไข้หวัดนกนั้น จะต้องทำการจำแนกด้วยว่าเชื้อไวรัสไข้หวัดนกที่ตรวจพบคือ เชื้อไวรัสไข้หวัดนกชนิดรุนแรง (Highly pathogenic notifiable avian influenza: HPNAI) หรือเชื้อไวรัสไข้หวัดนกชนิดไม่รุนแรง (Low pathogenic notifiable avian influenza: LPNAI) ซึ่งการแยกทำได้จากการวิเคราะห์กราฟการหลอมเหลว (Melting curve) ที่ได้จากกระบวนการ real-time PCR เนื่องจาก DNA แต่ละชนิดจะมีค่า Tm (Melting temperature เป็นอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเข้าคู่กันของสายดีเอ็นเอที่มีหมู่เบสเป็นคู่สมกัน) ที่แตกต่างกัน ซึ่งค่า Tm นี้จะแปรผันตรงกับเปอร์เซ็นต์ของเบส G และ C ที่อยู่ในสายดีเอ็นเอ (% GC content)

สรุป
        การตรวจสอบเชื้อไวรัสไข้หวัดนกด้วยวิธี real-time RT-PCR เป็นวิธีที่สามารถตรวจสอบได้อย่างแม่นยำ เมื่อร่วมกับการใช้เทคนิค multiplex real-time RT-PCR แล้ว ยิ่งทำให้วิธีนี้สามารถตรวจสอบได้อย่างรวดเร็วยิ่งขึ้น ซึ่งมีประโยชน์มากต่อการเฝ้าระวังการแพร่ระบาดของเชื้อ เพราะเมื่อสามารถตรวจสอบได้อย่างรวดเร็ว และแม่นยำ จะยิ่งทำให้การกำจัดและเฝ้าระวังทำได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น และเกิดความเสียหายน้อยที่สุด

เอกสารอ้างอิง
1. Enders K.O. Ng, Peter K.C. Cheng, Antia Y.Y. Ng, T.L. Hoang, and Wilina W.L. Lim, Influenza A H5N1
2. Detection, Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol.11; No.8 August 2005
3. Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans • WHO Geneva • June 2005
4. Menno D. de Jong, M.D., Ph.D., Tran Tan Thanh, M.Sc., et al. OseltamivirResistance during Treatment of Influenza A (H5N1) Infection, The new england journal o f medicine • www.nejm.org • december 22, 2005
5. Kate E. Templeton, Sitha A. Scheltinga, et al, Rapid and Sensitive Method Using Multiplex Real-Time PCR for Diagnosis of Infections by Influenza A and Influenza B Viruses, Respiratory Syncytial Virus, and Parainfluenza Viruses 1, 2, 3, and 4, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr 2004 Vol. 42 No. 4;p1564–1569
6. เอกสารประกอบการประชุมวิชาการไข้หวัดนกประจำปี 2548 วันที่ 27-28 กันยายน 2548 ณ โรงแรมรามาการ์เด้นส์, สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย สำนักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ

LAB.TODAY
บทความบางส่วนติดตามได้ในเล่ม
เว็บไซต์ที่เกี่ยวข้อง www.vertichrom.com, www.ligandsci.com