UV-Vis Spectrophotometer   เครื่องตรวจวัดสารด้วยการดูดกลืนแสง

เรียบเรียงโดย พรรณทิพย์ ตั้งปรียารักษ์
       สารอินทรีย์ สารประกอบเชิงซ้อน และสารอนินทรีย์โดยส่วนใหญ่สามารถดูดกลืนแสงหรือรังสีที่อยู่ในช่วงยูวีและช่วงความยาวคลื่นที่มองเห็นได้ (หรือแสงขาว) การวิเคราะห์สารดังกล่าวทั้งในเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณด้วยคุณสมบัตินี้จึงเป็นที่นิยมอย่างกว้างขวาง เพราะให้ความถูกต้องแม่นยำ และมีความไวสูง

บทนำ
        UV-Vis spectrophotometer เป็นเครื่องมือที่ใช้ในการตรวจวัดปริมาณแสงในช่วงรังสียูวีและช่วงแสงขาวที่ทะลุผ่านหรือถูกดูดกลืน
โดยตัวอย่างที่วางอยู่ในเครื่องมือ ความยาวคลื่นแสงจะมีความสัมพันธ์กับปริมาณและชนิดของสารที่มีอยู่ในตัวอย่างซึ่งโดยส่วนใหญ่จะเป็นสารอินทรีย์ สารประกอบเชิงซ้อน และสารอนินทรีย์ที่สามารถดูดกลืนแสงในช่วงความยาวคลื่นเหล่านี้ได้เครื่อง UV-Vis Spectrophotometer ในปัจจุบันได้รับการพัฒนาให้มีขนาดที่เล็กลง มีความไวมากขึ้น ให้ผลลัพธ์ที่ถูกต้องแม่นยำมากยิ่งขึ้น รวมไปถึงการพัฒนาโปรแกรมที่ใช้ควบคู่กันกับเครื่องมือในการวิเคราะห์ และการพ่วงต่อด้วยเทคนิคอื่นๆ ทำให้สามารถนำไปใช้งานได้กว้างขึ้น

รูปที่ 1 แถบสเปคตรัมของคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า

UV-Vis Spectrum
        คลื่นแม่เหล็กไฟฟ้ามีแถบสเปคตรัมตั้งแต่ช่วงความยาวคลื่นสั้น(รวมทั้งรังสีแกมมาและรังสีเอ็กซ์) ไปจนถึงช่วงความยาวคลื่นยาว (รวมถึงไมโครเวฟและคลื่นวิทยุ) รังสียูวีและแสงขาวเป็นเพียงส่วนเล็กๆ ส่วนหนึ่งของคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า โดยมีความยาวคลื่นประมาณ 190-800 นาโนเมตร

UV-Vis Spectroscopy
        ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา เทคนิค UV-Vis spectroscopy ได้ถูกนำไปใช้งานต่างๆ อย่างมากมาย แม้ว่าทุกวันนี้เครื่องมือที่นำเทคนิคนี้ไปใช้จะมีความแตกต่างจากเครื่องมือตัวแรกเป็นอย่างมาก แต่เครื่องมือเหล่านี้ก็ทำงานบนหลักการพื้นฐานเดียวกัน คือคุณสมบัติในการดูดกลืนแสงของสารเมื่อโมเลกุลของตัวอย่างถูกฉายด้วยแสงในช่วงรังสียูวีหรือแสงขาวที่มีพลังงานเหมาะสมจะทำให้อิเล็กตรอนภายในอะตอม
เกิดการดูดกลืนแสงแล้วเปลี่ยนสถานะไปอยู่ในชั้นที่มีระดับพลังงานสูงกว่า เมื่อทำการวัดปริมาณของแสงที่ผ่านหรือสะท้อนมาจากตัวอย่างเทียบกับแสงจากแหล่งกำเนิดที่ความยาวคลื่นค่าต่างๆตามกฎของ Beer-Lambert ค่าการดูดกลืนแสงหรือค่า absorbance ของสารจะแปรผันกับจำนวนโมเลกุลที่มีการดูดกลืนแสง ดังนั้นจึงสามารถระบุชนิดและปริมาณของสารที่มีอยู่ในตัวอย่างได้

รูปที่ 2 เมื่อได้รับพลังงานเพียงพอ อิเล็กตรอนภายในโมเลกุลมีการเปลี่ยนระดับ ชั้นพลังงาน รูปที่ 4 แผนผังแสดงส่วนประกอบของเครื่อง UV-Vis spectrophotometer แบบ ลำแสงเดี่ยว

รูปที่ 3 ตัวอย่างกราฟที่ได้จากการวัดตรวจสารด้วยเครื่อง UV-Vis spectrophotometer

UV-Vis Spectrophotometer
        เครื่อง UV-Vis Spectrophotometer เป็นเครื่องมือที่นำเทคนิค UV-Vis spectroscopy ไปใช้งาน เครื่องมือตัวนี้ทำหน้าที่ในการตรวจวัดความเข้มแสงที่ผ่านหรือสะท้อนจากตัวอย่างเปรียบเทียบกับความเข้มแสงจากแหล่งกำเนิด เครื่อง UV-Vis spectrophotometer โดยทั่วไปแล้วจะมีส่วนประกอบหลักๆ ที่เหมือนกัน ได้แก่แหล่งกำเนิดแสง เกรตติ้งหรือโมโนโครเมเตอร์ เซลล์ที่บรรจุ
สารตัวอย่าง และเครื่องตรวจวัด
         แหล่งกำเนิดแสงจะต้องให้แสงที่คงที่อย่างต่อเนื่อง ตัวที่นิยมใช้ คือ หลอดทังสเตน-ฮาโลเจน ซึ่งให้แสงที่มีความยาวคลื่นในช่วง
320-2,500 นาโนเมตร สำหรับแหล่งกำเนิดแสงในช่วงรังสียูวีนั้นจะใช้หลอดไฮโดรเจนหรือหลอดดิวทีเรียมซึ่งให้แสงในช่วงความยาวคลื่น 160-375 นาโนเมตร แต่แสงที่ได้จากแหล่งกำเนิดนั้นจะมีความยาวคลื่นต่างๆ ดังนั้นจึงต้องใช้โมโนโครเมเตอร์เป็นตัวกระจายแสงออกเพื่อให้แสงที่จะผ่านไปยังตัวอย่างมีความยาวคลื่นค่าเดียวตามที่ต้องการหลังจากนั้นแสงความยาวคลื่นค่าเดียวจะผ่านไปยังเซลล์ที่
บรรจุสารตัวอย่างและสารเปรียบเทียบ (cuvettes) ซึ่งมีรูปร่างต่างๆ กันออกไป แต่โดยส่วนใหญ่จะมีลักษณะเป็นกล่องทรงสี่เหลี่ยมผืนผ้าที่มีความกว้างภายใน 1 เซนติเมตร (ซึ่งค่านี้จะเป็นค่าระยะทางเดินของแสงที่ผ่านเข้าไปในตัวอย่างตามกฎของ Beer-Lambert) เครื่อง UV-Vis spectrophotometer บางรุ่น สามารถใช้หลอดทดลองเป็น cuvettes ได้ แต่ cuvettes ที่ดีที่สุดนั้นทำมาจากควร์ตที่มีคุณภาพสูง สำหรับ cuvettes ที่ทำจากแก้วหรือพลาสติกนั้นก็เป็นที่นิยมใช้กันทั่วไป แต่สามารถใช้ได้เฉพาะในช่วงแสงขาวเท่านั้นเพราะแก้วและพลาสติกดูดกลืนแสงในช่วงรังสียูวีแสงในส่วนที่ไม่ถูกดูดกลืนจะเดินทางผ่านตัวอย่างมาถึงเครื่องตรวจวัด สำหรับเครื่องตรวจวัดที่นิยมใช้ ได้แก่ PMT (photomultiplier tube), diode arrays และ CCDs (charge coupled devices) เครื่องจะทำการบันทึกค่าความยาวคลื่นร่วมกับค่ามุมของแต่ละความยาวคลื่นที่เกิดการดูดกลืน ผลของสเปคตรัมที่ได้จะแสดงในรูปของกราฟระหว่างค่า absorbance และค่าความยาวคลื่น
        เครื่อง UV-Vis spectrophotometer สามารถแบ่งได้เป็น 2 ระบบ คือ แบบลำแสงเดี่ยว และแบบลำแสงคู่ สำหรับเครื่องแบบ ลำแสงเดี่ยวเป็นเครื่องที่ใช้ลำแสงเดียวจากแหล่งกำเนิดผ่านไปยังตัวอย่าง เครื่องมือนี้ได้รับการออกแบบให้สามารถใช้งานได้ง่ายสะดวก และมีราคาไม่แพงมากนัก

รูปที่ 5 แผนผังแสดงส่วนประกอบของเครื่อง UV-Vis spectrophotometer แบบ
ลำแสงคู่

        สำหรับเครื่องแบบลำแสงคู่นั้น แสงจะถูกแยกออกเป็น 2 ลำ ก่อนที่จะไปตกลงบนตัวอย่าง โดยแสงลำหนึ่งจะใช้เป็นลำแสงอ้างอิงขณะที่อีกลำจะผ่านไปยังตัวอย่าง เครื่องมือที่เป็นแบบลำแสงคู่บางรุ่นจะมีเครื่องตรวจวัด 2 ตัวเพื่อที่จะตรวจวัดแสงอ้างอิงและแสงที่มาจากตัวอย่างได้พร้อมกัน แต่ในบางรุ่นจะมีเครื่องตรวจวัดเพียงตัวเดียว โดยแสงทั้งสองลำจะผ่านตัว beam chopper ซึ่งจะทำหน้าที่กักแสงลำหนึ่งไว้ในช่วงระยะเวลาหนึ่ง เครื่องตรวจวัดจึงสามารถตรวจวัดความแตกต่างของแสงทั้งสองลำได้

การวิเคราะห์เชิงคุณภาพ/ปริมาณ
         โดยหลักการแล้ว สเปคตรัมซึ่งเกิดจากการดูดกลืนแสงในช่วงรังสียูวีและแสงขาวของสารตัวอย่างจะแสดงคุณสมบัติเฉพาะของสารนั้นๆ ทำให้สามารถนำไปใช้วิเคราะห์สารชนิดต่างๆ ได้ แต่ทั้งนี้การวิเคราะห์ด้วยเทคนิคนี้เท่านั้นจะให้ผลได้เพียงคร่าวๆ เพราะลักษณะของสเปคตรัมของสารแต่ละชนิดที่ได้จะมีความกว้างมากและยังมีรายละเอียดอีกเยอะจึงต้องใช้เทคนิคอื่นๆ ร่วมวิเคราะห์ด้วย สำหรับการวิเคราะหส์ ารในเชิงปริมาณดว้ ยเทคนิค UV-Vis spectroscopy สามารถทำได้โดยใช้วิธีการทำกราฟมาตรฐานระหว่างค่า absorbance และค่าความเข้มแสง ดังนั้นเมื่อสามารถวัดค่า absorbance ของสารได้ก็สามารถหาปริมาณของสารที่จะวิเคราะห์ได้จากกราฟ

เทคโนโลยีในปัจจุบัน
        เครื่อง UV-Vis spectrophotometer ในปัจจุบันได้รับการพัฒนาให้มีขนาดที่เล็กลง มีความไวมากขึ้น ให้ผลลัพธ์ที่ถูกต้องแม่นยำมากยิ่งขึ้น รวมไปถึงการพัฒนาโปรแกรมที่ใช้ควบคู่กันกับเครื่องมือในการวิเคราะห์ และการพ่วงต่อด้วยเทคนิคอื่นๆ เช่น NIR ทำให้สามารถนำไปใช้งานได้กว้างขึ้น ในราคาที่ถูกลงผู้เขียนจะขอแนะนำตัวอย่างเทคโนโลยีปัจจุบันของเครื่องมือในแต่ละผู้ผลิต
        • 3 Detector System
        เทคโนโลยีนี้เป็นของ Shimadzu ที่ได้ทำการเพิ่มเครื่องตรวจวัดภายในเครื่อง spectrophotometer ซึ่งพัฒนาให้สามารถตรวจวัดแสงในช่วง NIR ได้ให้มีถึง 3 ตัวด้วยกัน ได้แก่ PMT (สำหรับการตรวจวัดแสงในช่วงรังสียูวีและแสงขาว) InGaAs และ PbS (สำหรับการตรวจวัดแสงในช่วง NIR) ทำให้ลดช่องว่างของช่วงการตรวจวัดระหว่างเครื่อง PMT และ PbS ได้
        • Lock It Down and Walk Away
        ในเครื่อง spectrophotometer รุ่นใหม่ๆ ของ Varian จะมีกลไก LockDown mechanism สำหรับยึดให้อุปกรณ์ต่างๆ ภายในตัวเครื่องอยู่ในตำแหน่งที่ถูกต้อง เพียงแค่กดปุ่มให้ระบบทำงานระบบนี้สามารถทำการเพิ่ม ลด หรือปรับเปลี่ยนอุปกรณ์ต่างๆ ในตำแหน่งเดิมที่ถูกต้อง ดังนั้นจึงเหมาะสำหรับงานวิเคราะห์ที่ใช้ระยะเวลานานและผู้ใช้ไม่มีเวลาในการจัดเตรียมหรือตั้งค่าต่างๆ
        • Local Control Software
        เครื่อง spectrophotometer ในรุ่นที่เป็นแบบ Stand-alone ของ Unico นั้น ตัวโปรแกรมต่างๆ ที่ใช้ในการวิเคราะห์ทุกโปรแกรมจะถูกใส่อยู่ในตัวเครื่องเรียบร้อยแล้ว (built-in) และสามารถปรับปรุงโปรแกรมให้มีความทันสมัยอยู่เสมอได้โดยผ่านทางอินเตอร์เน็ต
        • Micro-Focused Beam
        เทคโนโลยีนี้เหมาะสำหรับการศึกษาตัวอย่างที่มีปริมาณเพียงเล็กน้อย เช่น โปรตีน หรือดีเอ็นเอ ซึ่ง Beckman Coulter ได้พัฒนาเทคโนโลยีนี้โดยการให้เครื่องมือทำการโฟกัสแสงลงบนช่องสี่เหลี่ยมขนาดประมาณ 0.5 x 2.2 มิลลิเมตรบนเซลล์ที่บรรจุตัวอย่าง ซึ่งตัวอย่างยังคงได้รับพลังงานแสงทั้งหมด และลดการสูญเสียพลังงานจากวิธีการทำ masking บนเซลล์หรือวิธีการอื่นๆ

รูปที่ 7 เทคโนโลยี Micro-Focussed Beam ซึ่งจะช่วยลดการสุญเสียพลังงานของการตรวจวิเคราะห์สารที่มีปริมาณเพียงเล็กน้อย

บทสรุป
        เครื่อง UV-Vis spectrometer ของแต่ละผู้ผลิตต่างก็มีหลักการทำงานเดียวกัน เพียงแต่ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีทำให้เครื่องมือในแต่ละรุ่นมีความสามารถที่แตกต่างกันไป

เอกสารอ้างอิง
1. แม้น อมรสิทธิ์, อมร เพชรสม, หลักการและเทคนิคการวิเคราะห์เชิงเครื่อง
มือ, หน้า 33-107, ชวนพิมพ์, 2539
2. Kimberly S. Cleaves, Spectrophotometry on the Rise, Today's Chemist
at Work, December 2003, pp.17-18
3. http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtTxtJml/Spectrpy/UV-Vis/
spectrum.htm
4. http://en.wikipedia.org/wiki/UV/VIS_spectroscopy
5. http://www.globalspec.com
6. http://www.spectroscopymag.com
7. http://www1.shimadzu.com
8. http://www.varianinc.com
9. http://www.unico1.com
10.http://www.beckmancoulter.com